行业资讯

首页 > 新闻中心 > 行业资讯 > 正文

宏基因二代测序技术在新生儿重症监护室病原学诊断中的临床应用

发布时间：2024-09-06 来源：浏览次数：462

【摘要】

目的

探讨宏基因二代测序技术（metagenomics next generation sequencing，mNGS）在新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit，NICU）病原学诊断中的价值及其对临床决策的影响。

方法

回顾性选择2020年1月至2021年12月湖南省儿童医院NICU收治的疑似感染并同时行mNGS及传统病原学检测的新生儿为研究对象，分析mNGS在病原体检测中的敏感度、特异度及其对临床决策的影响。

结果

共纳入121例新生儿，男女性别比1.75∶1，足月儿64例，早产儿57例。mNGS阳性率为57.9%（70/121），明显高于传统检测方法（15.7%，19/121），差异有统计学意义（ P<0.001）。mNGS诊断的敏感度为94.7%，特异度为49.0%，阳性预测值为25.4%，阴性预测值为98.0%。根据mNGS结果，调整了65例（53.7%）患儿的治疗决策。

结论

mNGS具有极高的敏感度，可提高NICU感染患儿的病原体诊断率，亦可用于除外感染，指导临床治疗。

感染是新生儿患病和死亡的主要原因 ^［^1 ］，是全球新生儿死亡的第三大原因，占新生儿总死亡率的13% ^［^2 ］。早期准确的病原体诊断及有效的药物治疗至关重要。作为病原体诊断的金标准，传统的微生物培养技术检测周期长、敏感度低 ^［^3 ］，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术又只能测定几种特定的病原体，因此迫切需要一种快速、准确的病原体诊断技术协助诊断。宏基因二代测序技术（metagenomics next generation sequencing，mNGS）是近年出现的一种非靶向高通量测序技术，可在一个标本中同时进行成千上万个病原体（包括细菌、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、病毒、寄生虫等）的检测，在一定程度上弥补了传统检测方法的不足。目前mNGS临床应用的报道多见于成人，儿童尤其是新生儿相关报道较少。本研究对本中心新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit，NICU）收治的疑似感染性疾病并同时行mNGS和传统病原学检测的新生儿临床资料进行分析，探讨mNGS在NICU病原学诊断中的价值及其对临床决策的影响。

对象和方法

一、研究对象

回顾性选择2020年1月至2021年12月湖南省儿童医院NICU收治的患儿为研究对象。入选标准：（1）日龄≤28 d或校正胎龄44周内；（2）因疑似感染同时行mNGS检查和传统病原学检查。排除标准：病例资料不完整。本研究经本中心医学伦理委员会批准（HCHLL-2021-71）。

二、研究方法

1.资料收集：通过医院HIS系统查阅患儿病历并收集资料。（1）一般资料：性别、胎龄、出生体重、分娩方式、入院日龄、起病日龄、感染高危因素（羊水污染、胎膜早破、母亲绒毛膜羊膜炎、生殖道感染）、标本采集前抗菌药物暴露情况、发病至标本采集间隔时间、首发临床表现、转归等情况；（2）病程中实验室检测指标：血白细胞（white blood cells，WBC）最大值、最小值，血小板（platelets，PLT）最小值，全血C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）最大值，降钙素原（procalcitonin，PCT）最大值，白细胞介素（interleukin，IL）-6最大值；（3）治疗情况：抗生素使用情况、机械通气时间。

2.标本采集和检测：每例患儿至少采集两份同类型标本（血、深部痰液、脑脊液、腹水等），分别送检传统病原体检测及mNGS检测，结果回报后由临床医生根据患儿临床情况，与微生物学、临床药学专家综合评估，得到最终结果。（1）传统微生物培养方法：细菌培养参照微生物学检验标准进行，采集静脉血（1 ml以上）或脑脊液（1 ml以上）、腹水（3 ml以上），用吸痰管或支气管纤维镜经气管导管采集深部痰标本（2 ml以上），立即送检。（2）其他传统病原体检测方法：①免疫荧光法：咽拭子法采集深部气道分泌物，采用免疫荧光法对呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B及副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共7种呼吸道病毒进行抗原检测；②逆转录PCR：对脑脊液中的肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒通用型进行核酸测定；③酶联免疫吸附试验：检测血清肺炎支原体、衣原体抗体及TORCH。（3）mNGS检测 ^［^4 ］：采集静脉血（2 ml以上）、深部痰液（3 ml以上）、腹水（5 ml以上）、脑脊液（3 ml以上）后无菌封存，立即干冰冷链运送至杭州杰毅医学检验实验室进行mNGS检测。报告内容包含可疑致病病原体的种属、序列数、相对丰度、Q index值（根据标本人源核酸比例对序列数值进行校正后的定量数值）、疑似或人体共生微生物群信息。

3.相关诊断标准：新生儿败血症、化脓性脑膜炎、肺炎及腹膜炎的诊断均参照第5版《实用新生儿学》 ^［^5 ］。

三、统计学方法

应用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用方差分析及 q检验；非正态分布的计量资料以 M（ Q ₁， Q ₃）表示，组间比较采用 Mann-Whitney U检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用 χ ²检验或Fisher确切概率法。 P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般结果

研究期间共收治患儿4 261例，符合入选标准121例，男女性别比1.75∶1，其中早产儿57例，足月儿64例，49.6%为剖宫产娩出。胎龄37.4（30.1，39.1）周，最小胎龄26周；出生体重725~4 399 g。起病日龄11.0（4.5，26.0）d，27例（22.3%）起病日龄≤3 d。入院日龄18.0（7.0，29.0）d，最早于生后2 h入院。14例（11.6%）胎膜早破≥18 h，8例（6.6%）母亲绒毛膜羊膜炎，14例（11.6%）羊水污染，17例（14.0%）母亲围产期生殖道感染。

121例患儿常见首发症状为呼吸暂停或呼吸困难加重（45.5%，55/121），其次为发热（31.4%，38/121）、腹胀或呕吐（10.7%，13/121）。94例（77.7%）接受机械通气治疗（包括有创及无创）。

二、病原学检测结果

121例患儿中，送检静脉血标本60例、脑脊液标本31例、深部痰液标本27例、腹水标本3例，部分患儿送检了呼吸道病毒抗原、肺炎支原体抗体、衣原体抗体、TORCH、肠道病毒PCR等检测。传统培养标本留取时间为入院时或感染发生12 h内，mNGS标本采集时间为起病后9.0（3.5，18.0）d。

121例患儿中，mNGS检测阳性70例（57.9%），其中细菌49例、病毒10例、支原体或衣原体8例、真菌2例、分枝杆菌1例，共检出30种病原体，经mNGS明确了8例特殊感染：微小脲原体败血症、嗜肺军团菌败血症各2例，微小脲原体肺炎、先天性肺结核、解脲脲原体脑膜炎、腊样芽孢杆菌肺炎各1例；传统病原学检测阳性19例，其中细菌10例、病毒6例，支原体、分枝杆菌、真菌各1例，共检出14种病原体。

结合患儿临床表现及实验室检查结果综合评估，最终确诊败血症33例，病原体以肺炎克雷伯菌为主（6例），其次为表皮葡萄球菌（4例）、屎肠球菌（3例）；肺炎25例，检出率最高的病原体为肺炎链球菌（11例），其次为溶血葡萄球菌（3例）、沙眼衣原体（3例）；化脓性脑膜炎10例，检出率最高的病原体为大肠埃希菌（2例）；腹膜炎3例，检出病原体分别为屎肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌。

三、mNGS与传统检测方法比较

传统检测方法和mNGS总体阳性检出率为58.7%（71/121）。mNGS阳性检出率高于传统检测方法，差异有统计学意义（ P<0.001）。以传统病原学检测结果为金标准，mNGS的诊断敏感度为94.7%，特异度为49.0%，阳性预测值为25.4%，阴性预测值为98.0%。两种方法检测结果的一致性为56.2%（68/121）。

四、血液非特异性指标与mNGS结果的相关性

根据mNGS结果分为mNGS阳性组和mNGS阴性组，阳性组WBC最大值、CRP最大值、IL-6最大值高于阴性组，差异有统计学意义（ P<0.05）；两组WBC最小值、PLT最小值、PCT最大值比较差异无统计学意义（ P>0.05）。

五、抗生素暴露对病原学检测结果的影响

121例患儿中，74例（61.2%）在采集普通培养标本前有抗生素暴露，116例（95.9%）在mNGS标本采集前有抗生素暴露。在抗生素暴露患儿中，传统病原学检测与mNGS阳性检出率分别为10.8%、58.6%，差异有统计学意义（ P<0.001）。

六、治疗及转归

根据mNGS结果对65例（53.7%）患儿的治疗方案进行了调整，其中43例（35.4%）改为针对检出病原体的抗菌药物，15例（12.4%）减少了抗菌药物的种类或使用时间，7例（5.8%）考虑脑膜炎的患儿根据mNGS结果阴性、综合判断排除感染后停用抗菌药物。

121例患儿中，治愈好转100例（82.6%），死亡21例（17.4%），死亡原因与感染直接相关14例（11.57%），因严重神经系统后遗症放弃治疗后死亡2例，严重心肺疾病相关死亡5例。

讨论

感染是NICU新生儿死亡的重要原因 ^［^{6 , 7 , 8 , 9 ］}，各大医院NICU的抗生素使用率一直居高不下，提高病原体的诊断水平是合理使用抗生素、降低新生儿死亡率、改善预后的关键。近年来，mNGS作为一种新型的病原体检测方法逐渐应用于临床。mNGS不依赖特定基因引物的序列扩增，而是将样本的全部DNA和（或）RNA进行测序，然后将测序数据与病原体数据库进行比对，从而获得病原体信息。

既往多项研究显示我国NICU的主要致病菌为凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌 ^［^{10 , 11 , 12 , 13 ］}，与本研究中mNGS检出病原体基本一致。近年来有研究发现B族链球菌（group B streptococcus，GBS）已成为新生儿早发型败血症的重要致病菌 ^［^14 ］。而本研究中仅检出1例GBS，原因可能是本研究纳入患儿起病日龄较晚，仅27例生后72 h内起病，同时通过传统培养方法容易检出GBS，且GBS感染经青霉素治疗后效果较好，临床中不常对该类患儿再行mNGS检测。新生儿生后早期感染与母亲感染密切相关，而晚期感染多源于社区及医院感染，从而导致致病菌分布不同。

本研究中，mNGS显示出较高的诊断敏感度（94.7%），阳性率57.9%，远高于传统检测方法（15.7%）。近年一项针对35例新生儿败血症的研究显示，血mNGS阳性率（45.8%）明显高于传统方法（16.7%） ^［^15 ］；另一项包含新生儿在内的48例儿童化脓性脑膜炎研究中脑脊液mNGS阳性率为41.7%，也高于传统方法（25%） ^［^16 ］，均与本研究结论相似。既往多项针对成人、儿童的研究结果也支持这一结论 ^［^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 ］}。来自20多个国家的成人及儿童研究均表明mNGS在诊断疑难病例病原体方面更加实用 ^［^22 ］。近年来在新生儿群体中，也通过mNGS明确了包括脲原体、结核分枝杆菌、条件致病菌伊氏肺孢子虫在内的多种特殊病原体感染 ^［^{23 , 24 , 25 , 26 ］}。本研究通过mNGS检测出了5种新生儿不常见的特殊病原体。因此，建议对NICU感染病原体不明确的新生儿使用mNGS检测，避免出现遗漏、影响后续治疗效果。

血液非特异性指标，如WBC、PLT、CRP、PCT、IL-6等常联合用于新生儿败血症的临床诊断 ^［^27 ］。本研究中，mNGS阳性组的WBC最大值、CRP最大值、IL-6最大值较阴性组明显增高，说明WBC、CRP、IL-6水平较高者mNGS阳性检出率也较高。但另一项针对109例成人感染患者的研究表明mNGS阳性及阴性组的CRP、PCT无明显差异 ^［^28 ］，与本研究不符。目前关于血液特异性指标与mNGS结果之间的关系研究较少，仍需进一步论证。

抗菌药物暴露对传统细菌培养的结果影响较大。在抗生素暴露下，本研究中mNGS阳性检出率为58.6%，明显高于传统培养法（10.8%），提示抗菌药物对mNGS的影响较小，与既往研究结论相符 ^［^29 ］。可能原因为mNGS检测的是病原体的DNA/RNA片段，而非活体菌种。因此，对存在抗菌药物暴露的患儿，mNGS仍可作为重要的病原学诊断手段。

既往研究表明，不规范的抗生素使用不仅增加经济负担、药物不良反应风险、细菌耐药性 ^［^30 ］，而且可能增加新生儿不良结局风险 ^［^{31 , 32 ］}。本研究中，根据mNGS结果调整了65例（53.7%）患儿的治疗，最终使其获益，这对规范抗生素使用、减少抗生素相关不良结局有重要意义。

mNGS有敏感度高、单次检测病原体种类多、受抗菌药物暴露影响小、时效快等优点，但目前还存在一些不足：（1）无法提供微生物药敏信息。临床医生得到mNGS结果后仍需根据细菌种类选择可能的敏感抗生素。目前，mNGS可进行耐药基因检测，在一定程度上弥补了这一缺点，但仍无法替代传统细菌培养的药敏试验结果。（2）从标本中提取核酸时受来源影响较大，单位体积的人核酸含量排序为脑脊液<支气管肺泡灌洗液<血浆<痰液<胸腹水。本研究中有1例败血症患儿血培养阳性（大肠埃希菌），但mNGS阴性，考虑可能是受该因素影响。（3）在报告解读方面，mNGS通常不会只检出一种病原体，检出的病原体也可能是污染菌、定植菌。所以，最终需临床医生根据临床表型、其他实验室指标、应用微生物学和药理学知识综合判断致病菌。本研究中，新生儿专科医生联合微生物学专家、临床药学专家综合评估，以准确判读报告。

综上，mNGS具有很高的敏感度及一定的特异度，在NICU应用可使患儿受益。在传统病原学不能明确病原体时，建议积极开展mNGS检测。本研究不足之处在于本研究是单中心回顾性研究，存在样本量少、采样时间不一致等不足，可能存在选择偏倚，仍需更严格的试验设计、多中心的大样本研究。

倚，仍需更严格的试验设计、多中心的大样本研究。

引用本文

引用本文: 刘剑,刘银芝,占彩霞,等. 宏基因二代测序技术在新生儿重症监护室病原学诊断中的临床应用[J]. 中华新生儿科杂志（中英文）,2024,39:(09)：513-517.DOI:10.3760/cma.j.issn.2096-2932.2024.09.001.

上一篇：小于胎龄儿脐血非蛋白结合铁和氧化应激状况的研究

下一篇：低剂量的辐射会致癌吗？